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更新時間：2025-09-01 10:50
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牛骨主要由骨髓、骨質和骨膜三部分組成（鄭婭 等，2013），包含蛋白質、脂肪、鈣鹽、磷酸鹽等無機鹽、硫酸軟骨素以及水分等。牛骨中的有機相含有豐富的蛋白質，而無機相則富含鈣、磷等元素，這些成分含有人體所需的多種氨基酸和微量元素，而軟骨素和骨膠原等營養成分則主要存在于骨髓和軟骨中（鄭婭 等，2013； 阮孝慈 等，2017；RANI et al., 2017）。此外，牛骨富含礦物質，可以通過加工制成食品添加劑或將其制備為具有生物活性的羥基磷灰石的材料。骨重建是骨形成（成骨細胞負責）與骨吸收（破骨細胞負責）的動態平衡過程，當骨吸收速率大于骨形成速率時容易導致骨質疏松癥，因此成骨細胞負責的骨形成非常重要。YE 等人（2019）從牛骨膠原蛋白水解物中分離并鑒定出促成骨細胞活性的膠原蛋白肽并基于細胞實驗和動物實驗探究了其潛在機制。本課題組前期研究證實牛骨膠原蛋白肽（bovine bone collagen peptidesCPs）具有抗骨質疏松、促成骨細胞增殖、抑制骨丟失的生物活性（葉孟亮 等，2019），這表明牛骨可能是一種天然功能活性成分的良好來源，其中牛骨膠原蛋白肽可作為一種實現高效鈣吸收的潛在肽來源。
研究表明，相比于其他補鈣制劑而言，肽-鈣螯合物具有促進機體對鈣吸收和提高生物利用度的能力，且對胃腸道沒有副作用影響。
基于鈣結合能力，從牛骨膠原水解物中篩選出了一種新的鈣結合肽（Phe-Gly-Leu, FGL）。FGL 的潛在鈣結合位點主要包括羰基、氨基、羧基和苯環。Phe-Gly-Leu-Ca 的結構是鈣離子被Phe-Gly-Leu 通過配位鍵和離子鍵包圍并位于中心。此外，FGL-Ca的鈣透析百分比優于 CaCl2、CaCO3、乳酸鈣和葡萄糖酸鈣，并且 FGL-Ca 具有較好的鈣吸收轉運活性。
體外模擬消化是膳食營養研究中應用最廣泛的模型，是一種成熟的、可重復的評估礦物質生物利用度的方法。透析百分比提供了腸腔中可用于吸收（生物利用度）的鈣含量的一些信息。高透析性與更好的生物利用度正相關（WANG et al., 2021）。因此，采用體外消化法評價了 CaCl2、CaCO3、乳酸鈣、葡萄糖酸鈣和 FGL-Ca 的生物利用度差異。
如圖 3-8B 所示，FGL-Ca 的鈣透析率（56.33 ±0.92%）明顯高于其他鈣補充劑。這與之前的研究結果一致，即肽-鈣復合物具有更高的生物利用度（QU et al., 2022）。這表明 FGL-Ca 可能更容易被腸道吸收。這可能是因為 FGL-Ca減少了鈣沉淀，從而提高了其生物利用度。FGL-Ca 具有良好的透析性，表明 FGL-Ca 可能具有良好的生物利用度，具有作為鈣補充劑的巨大潛力。
目前，探究肽-鈣螯合物的吸收利用效果一般以 Caco-2 細胞作為鈣吸收和鈣轉運的細胞模型。作為一種人結腸癌上皮細胞系，Caco-2 細胞被廣泛用于人體腸道吸收藥物和其他化合物的模型（RICHARD et al., 2005）。在普通培養條件下該細胞系能自發地分化出小腸絨毛面基底側和頂側，并它的細胞極性、緊密性、水解酶系和各種營養物質轉運載體與小腸上皮細胞相同，因此被廣泛用于模擬體內鈣轉運和鈣吸收的實驗。
如圖 3-9B 所示，不同劑量的 FGL-Ca 處理組和 CaCl2 處理組在 Caco-2 細胞單層上的鈣轉運活性高于對照組（P < 0.05）。無論是 FGL-Ca 處理組，還是 CaCl2 處理組，隨著孵育時間的延長，轉運鈣濃度均顯著升高（P < 0.05）。孵育 120 min 時，與 CaCl2（0.1 mg）處理組相比，FGL-Ca（0.6 mg，含鈣 36.37 μg）處理組的鈣轉運顯著增加（P < 0.05）。此外，隨著 FGL-Ca 劑量的增加，鈣轉移量增加。特別是 1.0 mg 的 FGL-Ca 表現出最大的鈣轉運能力（P < 0.05），在 30、60、90和 120 min 時，鈣轉運量分別是對照組的 6.04、7.57、8.23 和 10.23 倍。上述結果表明，FGL-Ca具有較好的促進腸道鈣吸收的作用。
骨形成過程主要涉及四個步驟：成骨細胞增殖、成骨細胞分化、成骨細胞礦化和成骨細胞凋亡（SONG et al., 2021）。鈣敏感受體（CaSR）是 C 類 G 蛋白偶聯受體（GPCR），通過監測細胞外部 Ca2+濃度水平調節 Ca2+穩態。本文以 TCR 為陽性對照組，探討 FGL 與 CaSR 的相互作用。FGL 對接 CaSR 得到的-CE 值大于TCR 對接 CaSR 得到的-CE 值。這表明 FGL 有可能自發進入 CaSR 的 VFT 結構域。這表明 FGL可能是 CaSR 的正變構激活劑，這與 GUO 等人（2020）的研究結果一致，即富含芳香族氨基酸的多肽可能具有激活 CaSR 的潛力。隨后的 qPCR 和 Western blot 實驗也證實了上述推測。因此，FGL-Ca 表現出激活 CaSR 進而提高細胞內鈣濃度水平的潛在能力。
細胞外基質（extracellular matrix, ECM）分泌前在成骨細胞內合成，并在細胞增殖、分化和礦化等成骨過程中起著至關重要的作用（TAUBENBERGER et al., 2010）。結果表明，FGL-Ca 可顯著促進 COLⅠ的表達。COLⅠ是細胞外基質的主要成分，為骨基質礦化提供支架。這些發現與之前的研究結果一致（WU et al., 2020）。堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase, ALP）是一種同源二聚體蛋白，是骨形成過程中必不可少的酶，是成骨細胞增殖、分化和成熟的早期標志。此外，它是骨形成和代謝過程中的重要表型標記物（PENG et al., 2018; SAMITH et al., 2018）。因此，ALP 活性強度是評價成骨細胞分化和礦化的重要指標。骨保護素（OPG）是 TNF 受體家族的一員，與RANK 競爭 RANKL 作為誘餌受體。因此，OPG 是體外破骨細胞成熟和活化的有效抑制劑。研究表明，骨鈣素（OCN）的水平可以直接反映成骨細胞的活性，也是骨形成或骨轉化的特異而敏感的指標（KELLY et al., 2018）。結果表明，FGL-Ca 可顯著促進上述基因和蛋白的表達，從而增強成骨活性。
FGL-Ca 能顯著增強 MC3T3-E1 細胞的成骨活性（包括增殖、分化和礦化活性）。其潛在機制是 FGL-Ca 可激活 CaSR 以增加細胞內鈣離子濃度，誘導 TGF-β1 分泌并激活 TGF-β1/Smad2/3通路，進而增強 MC3T3-E1 細胞成骨活性。
牛骨膠原蛋白肽-鈣螯合物促MC3T3-E1細胞成骨活性及其潛在機制 FGL-Ca顯著增強MC3T3-E1細胞的成骨活性（增殖、分化和礦化）。鈣熒光標記和分子對接結果表明，FGL-Ca可能激活了Ca SR，導致細胞內鈣濃度升高，進而增強MC3T3-E1細胞的成骨活性。進一步研究發現，FGL-Ca可顯著促進Ca SR、TGF-β1、TβRII、Smad2、Smad3、OCN、ALP、OPG、COLⅠ的m RNA和蛋白表達水平。隨后，在信號通路干預實驗中，FGL-Ca促進TGF-β1/Smad2/3信號通路相關基因和蛋白的表達水平下降。上述結果表明，FGL-Ca可能通過激活Ca SR提高細胞內鈣濃度，進而激活TGF-β1/Smad2/3信號通路，這可能是FGL-Ca促成骨活性的潛在機制之一。齊立偉.牛骨膠原蛋白肽-鈣螯合物的結合機制及其促成骨活性研究[D].中國農業科學院,2023.DOI:10.27630/d.cnki.gznky.2023.000308.
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